一、PCR的引物怎样设计
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列.因此,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否.
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区.同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构.如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它.如这一段不能形成二级结构,那就可以在这一区域设计引物.
现在可以在这一保守区域里设计一对引物.一般引物长度为15~30碱基,扩增片段长度为100~600碱基对.
让我们先看看P1引物.一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%.而且四种碱基的分布最好随机.不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在.否则P1引物设计的就不合理.应重新寻找区域设计引物.
同时引物之间也不能有互补性,一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补.
引物确定以后,可以对引物进行必要的修饰,例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等,这对扩增的特异性影响不大.但3′端绝对不能进行任何修饰,因为引物的延伸是从3′端开始的.这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位,因为密码子第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率.
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：
① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性.
② 产物不能形成二级结构.
③ 引物长度一般在15~30碱基之间.
④ G+C含量在40%~60%之间.
⑤ 碱基要随机分布.
⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补.
⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补.
⑧ 引物5′端可以修饰.
⑨ 引物3′端不可修饰.
⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位.
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列.如前述,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否.对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功,但遵循某些原则,则有助于引物的设计.
1.引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源.
2.避开产物的二级结构区
某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域.用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构,有助于选择模板.实验表明,待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时,扩增往往不能成功.若不能避开这一区域时,用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的.
3.长度
寡核苷酸引物长度为15~30bp,一般为20~27mer.引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+,Ln值不能大于38,因为>38时,最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性.
4.G+C含量
G+C含量一般为40%~60%.其Tm值是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度,有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃.若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳.
5.碱基础随机分布
引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在.尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发.
6.引物自身
引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性.这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合.若用人工判断,引物自身连续互补碱基不能大于3bp.
7.引物之间
两引物之间不应不互补性,尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成.一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性.
8.引物的3′端
引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰.3′端也不能有形成任何二级结构可能,除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中,引物3′端不能发生错配.
在标准PCR反应体系中,用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP（四种dNTP各200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板,按95℃,25s；55℃,25s；72℃,1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下,引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的.A∶A错配使产量下降至1/20,A∶G和C∶C错七下降至1/100.引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的.
9.引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大.因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性.引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等.
10.密码子的简并
如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率.
特殊目的的引物设计将在有关章节讨论.随着人们对引物的认识,一些引物的计算机设计程序也应运而生,下面将讨论有关引物计算机设计方法.
现有的引物设计软件有primer5.0比较好.
二、如何用oligo设计基因敲除的引物
第一步：新建序列（或者通过Open直接打开序列）
第二步：确定你要设计引物的起始位点,双击下面的序列可以选中一段（暂时先不要管引物长度）
第三步：选择作为上游引物Select->Forward Primer,然后你会发现下面的序列上有相关引物
第四步：编辑引物,Edit->Forward Primer,可以在文本框中对引物进行添加或删除（在此步骤中加入酶切位点或/和保护碱基）,最下面是发夹结构情况,没有发夹结构最好,参与配对形成发夹结构的碱基对越少越好（此窗口还有Tm等信息）
第五步：分析引物Analyze->Duplex Formation->Forward Primer是上游引物形成二聚体情况,不形成最好,参与配对形成二聚体的碱基对越少越好；Analyze->****->Forward Primer（Analyze菜单中有很多可以对引物进行评估的功能,根据菜单名字便可知道）
第六步：设计下游引物（同上游引物设计）
第七步：将设计好的引物进行检查是否移码等等,然后从中Ctrl+C复制出来,
