我们以不同的蚊菌株对传播疾病的危害进行实验,而目前的方法依赖于具有挑战性的形态学技术或简单的二元分类,虽然无法识别蚊菌株具有传染性。但是在这项研究中,将研究快速蒸发电离质谱识别实验室饲养不同蚊子的蚊菌株。

我们先是使用了利物浦热带医学院维护的三种按蚊菌株:一种名为Kisumu的冈比亚按蚊菌株,一种名为Ngousso的An. coluzzii菌株和一种名为Moz的阿拉伯疟蚊菌株。所有26个菌株均在2 ± 80 °C和相对湿度(RH)为10±12%的L12:D1 h明暗循环下饲养。

试验开始前我们先把实验室中饲养的蚊子蛹进行收集,然后放入纸桶中24小时。此后,未出现的蛹将被移除或者再保留24小时。然后就开始标记年龄,然后进行分析样本是在出现后的不同日子收集的。

然后又根据部分结果,进行更为详细的描述。这将根据明显的形态差异将雌性与雄性分开,并吸入纸桶中,雄性被丢弃。蚊子要么通过在-20°C下冷冻来杀死,在这种情况下,样品被储存在冰箱中直到分析当天,要么通过将桶放在36-38°C下过夜而没有水源来脱水。

为了试验的多样性,我们又从野外迪伊河口的水池中收集碎屑埃埃和卡斯皮斯的野生蚊子,幼虫则从它天然繁殖池中收集,并在与它们来源相同的水中饲养成虫。成年蚊子全年饲养,冷冻杀死并在-20°C下储存不同时间长度,然后由REIMS在几个月内的不同日期进行分析。

随后把收集到的所有标本均按随机顺序进行分析。其他物种作为幼虫从内斯顿地区地点的池中收集。在幼虫阶段分析的标本在冷冻杀死之前,用MilliQ水过滤并冲洗2-3次。作为幼虫收集的标本,然后在成虫阶段进行分析。

然后玻璃罐中放入原始水在将蚊子饲养里面,之后间歇性地用酵母喂养。等到成年后,它们被捕获在附着在原始容器上的网中,该容器每 24 小时清空一次。成虫被冷冻杀死,它们的物种和性别根据标准钥匙进行形态鉴定。

对于蚊子幼虫分析后,我们比较了来自易于识别的池的幼虫,这些池基本上是单一蚊子物种的单一栽培。这是基于2018年至2022年的数据。在此期间,从产生伊蚊碎屑的水池中,从248只幼虫中出来的248名成虫是伊蚊碎屑。

然而这个水池是一个小的空心草地,在其底部存在有泥浆,而且每年曾多次被海水淹没而呈咸味。另一个是一个较大的水池,位于松树林中,从秋季到初夏充满雨水,并且具有相当酸性的土壤和有机碎屑基础,这两个水池对于每个物种来说都是不错的生存环境。

在收集完所有蚊子后,就开始进行兰斯分析,现将样品通过连接到Synapt G2Si仪器离子淌度四极杆飞行时间质谱仪的快速蒸发源进行分析。使用单极电外科铅笔燃烧或者蒸发标本,该铅笔连接到VIO 50 C电外科发电机,提供电流,并通过塑料管连接到源入口。

准备就绪后,就将仪器放置在样品下方的黑色导电橡胶垫上,充当对电极并促进电流流动。同样也为了避免在分析过程中吸入烟雾,燃烧过程在通风箱内进行。为了在分析过程中提高电导率并保护对电极,将样品放置在湿纸表面上的一张玻璃微纤维纸上。

在燃烧单个标本的全部生物量后,使用源入口上的氮气动力文丘里阀,通过铅笔和连接的3米长的管道将气溶胶吸入REIMS源中。为了增加气溶胶捕获,在电外科铅笔的尖端上额外放置了一块宽口径塑料管。

随后将其纳入文丘里管的哨子里面,再将气溶胶以及亮氨酸脑啡肽在丙-2-醇中的锁定质量溶液引导到源中。这样做不仅可以过滤进入的气溶胶,还可以防止较大的颗粒进入入口毛细管。而对于源内的标本,电离颗粒通过与加热的撞击器接触而脱聚。

最后将所得出的信息进行汇总,然后进行数据分析。但是对于离线模型生成器,分析出的标本烧伤事件是单独定义的,对每个选定区域内的所有MS扫描求和。其他预处理参数包括强度阈值,设置在4e5和9e5之间,使用锁定质量和背景减法进行光谱校正。

在进行校正的同时,对离线模型生成器构建的模型,我们也进行了交叉验证,以便我们获得正确的分类率,以及显示每个分类的正确和错误识别样本数量的矩阵。为了进一步测试鉴别,样本分类是随机的,数据是重新分析的,期望是样本的随机分布和无法实现分离。

然而这些数据基于 PC-LDA 的模型是在过度拟合模型之前使用主成分 (PC) 的数量构建,方便为我们提供最佳的分离。为了确保在使用是出现较少方差时仍然可以分离类,所以仅使用每个模型可能的最大PC数量的四分之一来构建模型。

但是相比于兰斯的性能,可以与之相互媲美,这样做出的分析更具有高通量的潜力,并且该分析方法可以驱动或支持其他方法,并生成正交数据集。因此,这种高通量方法有可能对病媒种群进行快速、实时的监测,为替代干预措施的影响提供昆虫学证据。